M5 HiperScript III Reverse Transcriptase

使用说明书

产品名称                      单位        货号

M5 HiperScript III Reverse Transcriptase   10000U     MF310-01

M5 HiperScript III Reverse Transcriptase   5×10000U   MF310-05

【储存条件】

长期保存，请置于-20˚C，有效期24个月。

【产品简介】

M5 HiperScript III Reverse Transcriptase是基因工程改造后的M-MLV反转录酶(莫洛尼氏鼠白血病病毒pol基因)，降低了RNA酶H活性，增强了热稳定性。由于M5 HiperScript III Reverse Transcriptase可以在高至55°C下合成cDNA第一链，从而能得到比其它的反转录酶特异性更好、产量更高的cDNA，并且更多的全长cDNA。M5 HiperScript III Reverse Transcriptase从100 bp到12 Kb以上的cDNA。

【单位定义】

1单位指以poly(A)为模板、oligo(dT)₂₅为引物，在37°C条件下，10分钟内催化1 nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

【产品组分】

                                            MF310-01        MF310-05

M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)       50 μl           5x 50 μl

5× M5 HiperScript III RT Buffer                        500 μl          5x500 μl

贮存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25°C)，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM Dithiothreitol (DTT)，0.01% Nonidet ^TM P-40 (NP-40) (V/V)，50%甘油(V/V)。

【适用范围】

合成cDNA第一链，用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

制备带标记的cDNA探针，用于microarray研究；DNA标记和引物延伸法分析RNA。

【质量检测】

核酸外切酶活性：50 μl反应体系中，500 U本酶与1 μg的pUC19质粒于37°C温育4小时，电泳条带无明显变化。

核酸内切酶活性：50 μl反应体系中，2000 U本酶与1 μg的Hind III消化的λDNA于37°C温育4小时，电泳条带无明显变化。

RNase活性：25 μl反应体系中，1000 U本酶与250 ng的大肠杆菌rRNA于37°C温育2小时，经琼脂糖电泳检测，被降解的rRNA小于1%。

纯度：经SDS-PAGE (考马斯亮蓝染色) 检测其纯度大于90%。

【使用方法】

A．第一链cDNA的合成：(以下20 μl 的反应体系可以用于反转录10 pg-5 μg总RNA或10 pg-500 ng mRNA)

1. 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中

1 μl         oligo(dT)₂₀(50 μM)或200–500 ng oligo(dT)_12-18或50–250 ng随机引物或2 pmole基因特异性引物

10 pg-5 μg   总RNA或10 pg-500 ng mRNA

1 μl         10 mM dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10 mM，pH中性)

加入灭菌蒸馏水至14 μl。

2. 混合物在65°C加热5分钟后，迅速置于冰上冷却至少1分钟。

3. 短暂离心收集组分后，加入：

4 μl  5× M5 HiperScript III RT Buffer

1 μl  RNase抑制剂(40 U/μl)*

1 μl  M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)**

* RNase抑制剂不随酶附送，需要单独采购。如果起始RNA的量小于50 ng，则必须加入RNase抑制剂。

** 对于长cDNA片段(>5 kb)，使用oligo(dT)₂₀或基因特异性引物在50°C之上反应时，增加M5 HiperScript III Reverse Transcriptase (200U/μl)的用量至400U (2 μl)可以增加cDNA的产量。

4. 用枪头反复吸打混匀组分，如果使用的是随机引物，应在25°C下孵育5分钟。

5. 50°C孵育30-60分钟，如果使用基因特异性引物、复杂模板或富含二级结构的模板需将反应温度增加到55°C。

6. 在70°C加热15分钟以终止反应。

注意：cDNA产物可以直接作为PCR的模板。如果扩增的PCR产物大于1 kb，则需要去除与cDNA互补的RNA。可以使用1 μl(2 U)的E.coli RNA酶H在37°C孵育20分钟以去除与cDNA互补的RNA。

B．PCR反应体系和程序：

1. 在PCR反应管中加入下列成分：

10× Taq PCR缓冲液                                                5 μl

50mM MgCl₂                                                     1.5 μl

10mM dNTP混合物                                               1.0 μl

上游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

下游扩增引物 (10 μM)                                            1.0 μl

Taq DNA聚合酶 (5 U/μl)                                          0.4 μl

2 μl cDNA (来自于第一链合成反应)                                 2.0 μl

灭菌蒸馏水                                                     至50 μl

2. 变性: 94°C加热2分钟。

3. 进行15个到40个PCR循环。退火和延伸条件需要根据Taq DNA聚合酶而设定。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。