M5 M-MuLV Reverse Transcriptase

(RNase H-)使用说明书

产品名称                  单位        货号

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase   10000U     MF009-01

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase   5×10000U   MF009-05

【储存条件】

长期保存，请置于-20˚C，有效期24个月。

【产品简介】

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) 是利用基因工程技术，对M-MuLV 反转录酶的基因进行定点突变改造后，通过原核重组表达、柱层析纯化得到的反转录酶，适用于常规反转录反应、RT-PCR扩增、实时定量RT-PCR等实验的第一链cDNA合成。经过多重定点突变的M-MuLV反转录酶不仅去除了RNase H酶活性，而且增加了该酶与模板-底物的亲和力，合成的cDNA产量更多、更长(可以高效合成长达13kb的全长第一链cDNA)。此外，该酶对于高温有更强的耐受性(在50˚C仍具有活性)，可以使用较高的反转录反应温度，因此更好地克服了因模板RNA的二级结构而引起的反转录困难现象。

【单位定义】

活性单位的反转录酶定义为在42˚C、10分钟条件下，使1 nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量.

【产品组分】

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) (200U/μl)      50 μl  

5× M5 M-MuLV RT Buffer*                                 500 μl  

(5× M5 M-MuLV RT Buffer 成分：250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25°C), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM DTT)

【适用范围】

合成cDNA第一链，用于RT-PCR和实时RT-qPCR, 用于克隆和表达研究。

制备带标记的cDNA探针，用于microarray研究；DNA标记和引物延伸法分析RNA。

【使用方法】

A．<注意事项>

实验过程中请注意避免 RNase 污染。

RNA模板的完整性对cDNA合成效率起着决定性作用，因此请选择可靠的RNA提取/纯化方法。建议使用聚合美M5 Total RNA Extraction Reagent(货号 MF034-01) 制备高质量的 RNA 模板，并设置反转录反应阳性对照。

由于所有的 RNA 提取方法都不能完全去除基因组 DNA，所以应根据后续实验的需求，选择是否需要在反转录反应前去除残留基因组 DNA。RNase-free DNase I处理的具体方法见本说明书后面。

 M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)以 RNA 为模板获得全长的第一链 cDNA，其起始位点由所用引物所决定：

1) 随机引物(Random Primer)在 RNA 模板上没有特异性结合位点，所有 RNA 都可以做为第一链 cDNA 合成的模板；

2) Oligo dT Primer 只能以 poly(A) mRNA 作为 cDNA 合成的模板；

3) 采用序列特异性引物 (GSP) 以其结合位点为起始位点。

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)合成的第一链 cDNA 产物可直接加入 PCR 反应混合物中进行扩增，但加入体积不应超过 PCR 反应总体系的 10%，否则影响目的片段的产量。PCR 扩增使用的耐热 DNA 聚合酶和热循环条件需要根据目的片段的大小、GC含量、引物特性、以及对保真度的要求等进行选择。

第一链 cDNA 合成产物经过处理后可作为第二链合成的模板，合成含各种标记的 cDNA，作为杂交实验的探针。

RNA 应置于-70˚C以下保存，cDNA 合成产物应置于-20˚C保存。

B．<标准操作流程> (适于复杂模板或对扩增产量要求较高的实验)

在 DNase/RNase-free 离心管中依次加入下列成分：

1) RNA 模板：                    ≤8 µl （总 RNA 1~5 µg；poly(A) mRNA  0.1~0.5 µg）

2) 引物：                           1µl（Oligo dT引物/Random引物50 μM; 引物/序列特异性引物50μM）

3) 10 mM dNTP Mix：                1μl

4) DEPC-ddH₂O 补足至            14.5μl

混匀，短暂离心，65˚C加热 5 分钟，打开 RNA 的二级结构；

立即置于冰上至少 1 分钟，避免 RNA 的二级结构重新形成；

向管中加入：

5× M5 M-MuLV RT Buffer            4 μl

RNase Inhibitor                   0.5 μl

轻轻混匀，短暂离心；如果采用 Oligo dT 或序列特异性引物，42˚C温育 2 分钟；如果采用随机引物，25˚C温育 2 分钟；

加入 1μlM5 M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)，轻轻混匀；如果采用随机引物，25˚C温育 10 分钟；

42˚C温浴 50 分钟；

85˚C加热 5 分钟使酶失活；

置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

<简化操作流程>(不适于复杂模板或对扩增产量要求较高的实验)

在 DNase/RNase-free 离心管中加入下列成分：

5× M5 M-MuLV RT Buffer           4 μl

RNase Inhibitor                  0.5 μl

10 mM dNTP Mix                  1 μl

RNA 模板                      ≤8 μl (1~5 µg 总 RNA 或 0.1~0.5 µg poly(A) mRNA)

引物                             1 μl (50 μM Oligo dT引物/ Random引物/20μM 序列特异性引物)

M5 M-MuLV Reverse Transcriptase  1 μl

DEPC-ddH₂O             补足至 20 μl

轻轻混匀，短暂离心； 42˚C温浴 50 分钟；

85˚C加热 5 分钟使酶失活；马上置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

【补充说明】

以下流程为选做步骤，请根据实验情况酌情选择

1．RNase-free DNase I 处理 RNA 模板的方法：

1) 在 DNase，RNase-free 离心管中加入下列试剂：

RNA                         2-5μg

10× DNase I buffer               1μl

DNase I (2 U/μl)               0.5 μl

RNase Inhibitor               0.25 μl

DEPC-ddH₂O           补足至 10 μl

2) 混匀，短暂离心，37˚C放置 30 分钟；

3) 加入 1 μl 50 mM EDTA，65˚C放置 15 分钟使 DNase I 失活;或者直接使用酚/氯仿抽提去除 DNase I；

4) 为避免干扰反转录体系，RNA 加入量最好不超过反转录体系的 1/5，如果 RNA 浓度过低，建议沉淀浓缩后使用。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。