M5 Pfu DNA Polymerase 使用说明书

Product              Unit         Cat.#

M5 Pfu DNA Polymerase        500U        MF614-01

M5 Pfu DNA Polymerase       5x500U       MF614-05

【Storage】: Shipped at -20°C.

【产品介绍】：

Pfu DNA Polymerase是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，具有5′-3′DNA聚合酶活性和3′-5′外切酶活性，因此在DNA扩增过程中具有纠错能力，其保真性是Taq DNA Polymerase的6-8倍。另外该酶与Taq DNA Polymerase相比具有更好的热稳定性，对于高GC含量模板，提高变性温度对它活性无影响。使用本产品扩增得到的PCR产物为平端，不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。本产品适用于基因克隆、基因定点突变、SNP和末端补平等实验。

【产品组分】：

                              MF614-01      MF614-05

Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl     100 μl         5x100 μl

10×PCR Buffer                 1.0 ml         5x1.0 ml

注意：本产品的10×PCR Buffer中含有25 mM镁离子。

【单位定义】：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。

【质量控制】：经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温存放一个月，无明显活性改变。

【操作步骤】：

以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1. PCR反应体系

试剂                          50 μl反应体系                  终浓度

10×PCR Buffer                     5 μl                          1×

dNTP Mix，10 mM each             1 μl                    200 μM each

Forward Primer，10 μM             2 μl                       0.4 μM

Reverse Primer，10 μM             2 μl                       0.4 μM

Template DNA                  <0.5 μg                     <0.5 μg/50 μl

Pfu DNA Polymerase, 5 U/μl        0.5 μl                      2.5U/50 μl

ddH₂O                       up to 50 μl

注意：

1）用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，引物长度大于18个碱基，引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2）Pfu酶3′-5′外切酶活性可能降解引物，所以应先加dNTP后，再加Pfu酶到反应体系中，并立即进行PCR反应。

2. PCR反应条件

步骤             温度           时间

预变性           94℃          2 min

以下3个步骤循环25-35次：

变性             94℃          30 s

退火           55-65℃          30 s

延伸             72℃          60 s

终延伸           72℃          5 min

注意：

1）Pfu酶的热稳定性比Taq酶好，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对Pfu酶的活性无影响。

2）一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。

3）Pfu酶具有3′-5′外切酶活性，所以Pfu酶扩增时延伸速度远比Taq酶低，延伸时间根据所扩增片段大小设定，本产品的扩增延伸速率为1 kb/min。

4）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

5）本产品具有3′-5′外切核酸酶活性，PCR产物3’端不带“A”,不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。

Please note: All products are "FOR RESEARCH USE ONLY AND ARE NOT INTENDED FOR DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC USE"