尊敬的聚合美粉丝：

非常感谢您对聚合美的支持和对新事物的拥抱，

使用本产品前请认真阅读《温馨提示》和《操作说明书》。

“繁可简”系列多糖多酚植物RNA提取试剂盒使用“温馨提示”：

• “繁可简”系列产品针对的是多糖多酚植物RNA提取。普通植物RNA提取建议用聚合美MF035，MF037或者MF610来做，因为杀鸡焉用牛刀，上述3个货号更便宜，节省实验室经费。

• “繁可简”系列产品最大特点：不需要苯酚，氯仿等有毒试剂，也不需要乙醇沉淀；可在25-30分钟内完成单个样本提取。不同样本RNA含量差异非常大，通常100mg样本能提到05-5ug甚至更高的高质量RNA。

• 常见多糖多酚植物包括：中草药如石斛/丹参/雪莲/人参；植物果实如葡萄/蓝莓/草莓/香蕉/苹果/梨/西瓜果肉/紫菜/仙人掌/芦荟；复杂花卉和园艺植物如月季/玫瑰/梅/牡丹花/冬青/松针/沙棘/胡杨等。以及用其他品牌提不出来的样本，都可以认为是多糖多酚样本。

• 处理的样本尽量新鲜采集，然后马上提取。如果需要长期保存样本，请用聚合美的“完璧纯”样本保存液（MF150），切勿用trizol或者-80度直接保存，以防RNA降解。具体原因可以参考聚合美公众号文章。

• 提完RNA，不能只测OD值，必须要跑RNA电泳(简易RNA电泳条件同DNA电泳，只需要把电泳槽、梳子和胶板洗干净，用新的琼脂糖和电泳缓冲液配胶，跑胶：胶浓度1%；1×TAE电泳缓冲液；120V，15 min)。可以通过28S，18S，5SrRNA的条带来判断RNA的质量。

• 只能通过电泳结果来判断RNA的质量。RNA的质量包括：完整性（28S：18S=2:1）、纯度（有没有蛋白污染，有没有gDNA污染，其他杂质污染等）和浓度。

• 只有在RNA没有降解，也没有污染的情况下，才能用OD值算RNA的浓度。要知道，如果RNA降解了，OD变大，有蛋白污染OD也会变大，如果有gDNA污染OD也变大。

• 因为多糖多酚植物样本组分非常复杂，如果提取出来的RNA电泳结果图显示有gDNA污染，也是非常正常的，不必惊慌。后续反转录可以用带gDNA清除的试剂盒（聚合美MF949）来处理，不影响qPCR结果。

• 聚合美在多糖多酚植物RNA提取领域的技术是顶尖的，我们敢于和任何品牌同场竞技，接受现场PK。结果以电泳图为准，不能靠OD值。因为我们知道某些品牌存在人为操控，使得OD值比我们高很多，但是电泳条带不如我们，后续反转录和qPCR实验中他们的Ct值更大。

M5 HiPer Herbal Medicine Plant RNeasy Mini Kit

“繁可简”中草药植物RNA提取试剂盒

使用说明书

产品名称                  单位       货号

M5 HiPer Herbal Medicine Plant RNeasy Mini Kit    50T    MF996-01

【储存条件】  常温保存，组分若有沉淀，在37˚C水浴加热恢复澄清后使用。

【产品简介】

“繁可简”中草药植物RNA提取试剂盒，不需苯酚、氯仿，含有独家基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。本产品具有强大的提取能力，针对中草药植物RNA提取，把试剂盒组分进行了专门的优化，很多其他品牌提取失败的样本，我们能轻松提取出来。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶， 离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过， 吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H₂O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

【产品特色】

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在25-30分钟内完成。

3. 3.基因组DNA清除柱技术有效清除gDNA残留，得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

4. 4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达0-2.2。

【产品组份】

          50T                     注意事项

裂解液CLB                                 50ml        

裂解液RLT Plus                             25ml        

去蛋白液RW1                               40ml       

漂洗液RW                                  10ml       初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇

RNase-Free H₂O                            10ml        

基因组DNA清除套管                        50套       

RNase-Free吸附套管(RA)                    50套       

【注意事项】

1. 所有的离心步骤均在室温完成（4˚C离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。

2. 需要自备β-巯基乙醇、乙醇（尽量新开封或者RNA专用），研钵。

3. 裂解液CLB、RLTplus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4. 样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

5. 预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。

2) 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150˚C烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37˚C放置过夜，高压灭菌。）

6. 关于DNA 的微量残留：

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本产品采取了独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

【操作步骤】

<实验前请先阅读注意事项，第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量的无水乙醇!>

实验前准备：取1ml裂解液 CLB至离心管内 (如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇（1ml CLB加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。

1. 直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法）:

1. 新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100-200mg（水分少的样品可加100-150mg，水分多的样品可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入 1ml CLB（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

<β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%>。

1. 将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

1. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

<若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可>。

1. 立刻接操作步骤的步骤3。

2. 液氮研磨法（适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:

1. 液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

1. 转移100-200mg细粉（水分少的样品可加100-150mg，水分多的样品可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

1. 短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

1. 将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

1. 取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

<若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可>。

1.  立刻接操作步骤的步骤3。

3. 将混合物 (每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。

4. 将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5. 立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

<确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间>。

6. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。

8. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H₂O（事先在 70˚C水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

10. 如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase-Free H₂O重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

<洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择>。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。