产品名称                                  单位        货号

 M5 EndoFree Plasmid Mini Kit    50T       MF077-01

M5 EndoFree Plasmid Mini Kit   4x50T      MF077-04

【储存条件】

常温运输，室温（15~30˚C）保存。

【产品简介】

内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种简单、快捷、高效提取无内毒素质粒的新方法，提取的质粒最大限度去除内毒素，并能有效去除基因组DNA、RNA、蛋白等污染，操作简单方便。

　　本试剂盒适合提取1-5 ml菌液，在碱裂解法裂解细胞的基础上,通过新型硅基质膜高效专一的结合质粒DNA，每个吸附柱最高可吸附40 μg的质粒DNA，同时采用特殊的缓冲液系统和除内毒素过滤柱，有效去除内毒素、蛋白等杂质。由本试剂盒所得质粒纯度高、质量稳定，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等下游实验。

【产品组份】

                                50T                                    

Buffer P1                      15 ml                     

Buffer P2                      15 ml                       

Buffer E3                      15 ml 

Buffer PS                      15 ml                   

Buffer PW (concentrate)         10 ml                   

Endo-Free Buffer EB            10 ml      

RNase A（10 mg/ml）          150 μl  

Endo-Remover FM

With Collection Tubes            50

Spin Columns DM              

With Collection Tubes            50                        

【实验准备】

1．所有组分可在干燥、室温（15-30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2-8℃可保存更 长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。

2．第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2–8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。

3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

4．使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。

5．注意不要直接接触Buffer P2和Buffer E3，使用后应立即盖紧盖子。

6．提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。

【自备试剂】

无水乙醇、异丙醇

【操作步骤】

1．取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，13,000 rpm（~16,200×g）离心30秒收集细菌，尽量吸弃全部上清。

2．向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。

3．向离心管中加入250 μl Buffer P2，温和上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

4．向离心管中加入250 μl Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。13,000 rpm离心5分钟，吸取上清，将上清加入过滤柱（Endo-Remover FM）中，13,000 rpm离心1分钟过滤，滤液收集在离心管（自备）中。

注意：Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

5．向滤液中加入225 μl异丙醇，上下颠倒混匀。

6．柱平衡：向已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中加入200 μl Buffer PS，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7．将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱（已装入收集管）中。

8．13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的最大容积为750 μl，如果样品体积大于750 μl可分批加入。

9．向吸附柱中加入750 μl Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

将吸附柱重新放回收集管中，13,000 rpm离心1分钟。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。

将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入50-100 μl Endo-Free Buffer EB，室温放置2-5分钟，13,000 rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。

注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，13,000 rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

2）质粒拷贝数较低或>10 kb时，Endo-Free Buffer EB在65-70℃水浴预热，可以增加提取效率。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。