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M5 PurePlasmid Maxi Kit        10T       MF121-01

【储存条件】

15-25℃干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2-8℃。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A后的Solution I应置于2-8℃保存，可稳定保存6个月。若溶液II产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀后再使用。

【产品简介】

本试剂盒适用于高纯度质粒DNA的大量制备与纯化，操作简单。菌体经改良的碱裂解处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。通过去蛋白液和漂洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质，最后得到高纯度的质粒DNA，所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、细胞转染等分子生物学实验。

【产品特色】

快捷、高效：颜色变化，适合判断；操作简便，得率高，节约时间；

纯度高：沉淀致密，去杂干净；

【产品组份】

注意：使用前将全部RNase A溶液加到Solution I中混合均匀，2-8℃保存；按要求在Buffer WB2中加入无水乙醇）

【注意事项】

细菌培养时间一般为12-16 小时（用锥形瓶或者试管摇菌，留够足够的空间让细菌接触空气，利于细菌生长），如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒DNA突变；

每次使用时都要注意Solution II和N3是否形成沉淀，如有沉淀37℃溶解后再用；

加入Solution II裂解细菌，直至溶液成紫红色粘稠透明状，时间过长会导致质粒DNA打断变性；

质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。

【操作步骤】

柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入2.5 ml的平衡液BL，10,000 rpm 离心2 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

取100-200 ml（低拷贝质粒可收集更多菌液，最高300ml菌液）过夜培养的菌液，室温10,000 rpm离心2 min，弃上清。

加入10 ml Solution I，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀，呈现出均匀混浊的棕红色。

注意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低。

加入10 ml Solution II，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠的紫红色。

注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Solution II的用量，在后续的操作中Solution N3的用量也要相应增加。

加入10 ml Solution N3，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的絮状物产生，继续混匀直到完全变为黄色。然后10,000 rpm离心10-30 min，将上清转移至干净离心管（自备）中，注意不要带入沉淀。

注意：1）Solution N3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有紫色漂浮物，说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。

2）离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜，注意不要倒入吸附柱。

（如果实验室离心机采用吊篮式，不是固定转子，转速达不到10000rpm，可以采用吊篮离心的最大转速4250g，离心10-30分钟）

加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。

注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。

将混合溶液转移到平衡好的吸附柱中（使用当天用平衡液处理的吸附柱，放入50 ml收集管中），10,000 rpm离心1 min，弃收集管中的滤液。

注意：吸附柱的最大容积为15 ml，所以上步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过10 ml，以防发生漏液现象。

加入10 ml Buffer WB2，室温10,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。

注意：Buffer WB2为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发。

加入5 ml Buffer WB2，室温10,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。

室温10,000 rpm离心5 min，甩干残留液体。

将离心吸附柱置于一个新的50 ml塑料离心管中，打开管盖，放置5 min，使乙醇彻底挥发干净。

加入1-2 ml 洗脱液Buffer EB，室温放置2 min，10,000 rpm离心2 min，离心管底溶液即质粒DNA。

注意：为增加洗脱效率，可将得到的质粒溶液重新加入到吸附柱中重复步骤11一次，如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在7.0 - 8.5之间。

【低拷贝或大质粒（>10 kb）提取】

低拷贝质粒，或>10 kb的质粒，或提取农杆菌质粒，或提取革兰氏阳性菌质粒，应加大菌体使用量，使用300-500 ml过夜培养物，最后洗脱液Buffer EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。