产品名称                                                                       单位      货号

M5 Hiper Multi-color Endofree Pureplasmid Maxi Kit    10T   MF032-01

【储存条件】

室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。加入RNase A后的Solution I应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。若溶液II产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀后再使用。

【产品简介】

本试剂盒适用于无内毒素高纯度质粒DNA的大量制备与纯化，柱上去除内毒素，操作简单。菌体经改良的碱裂解处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜吸附。通过去蛋白液和漂洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质，最后得到高纯度的无内毒素质粒DNA，所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、细胞转染等分子生物学实验。

【产品特色】

快捷、高效：颜色变化，适合判断；操作简便，得率高，节约时间；

纯度高：沉淀致密，去杂干净；

内毒素去除简单：柱上去除内毒素，方便快速，清除干净。

【产品组份】

注意：使用前将全部RNase A溶液加到Solution I中混合均匀，2 ~ 8℃保存;按要求在Buffer WB2中加入无水乙醇）

【注意事项】

细菌培养时间一般为12 ~ 16 小时（用锥形瓶或者试管摇菌，留够足够的空间让细菌接触空气，利于细菌生长），如接种量大则应减少培养时间，过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒DNA突变；

每次使用时都要注意Solution II和III是否形成沉淀，如有沉淀37℃溶解后再用；

加入Solution II裂解细菌，直至溶液成紫红色粘稠透明状，时间过长会导致质粒DNA变性；

质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。

【操作步骤】

柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入2.5 ml的平衡液BL，10,000 rpm 离心2 min，弃收集管中滤液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

取100 ~ 200 ml（如果是低拷贝质粒可以收集更多菌液）过夜培养的菌液，室温10,000 rpm离心2 min，弃上清。

加入10 ml Solution I，旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀，呈现出均匀混浊的棕红色。

注意：菌体沉淀一定要悬浮均匀，如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低。

加入10 ml Solution II，温和颠倒混匀使菌体完全裂解，直到溶液变成清亮、粘稠的紫红色。

注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加Solution II的用量，在后续的操作中Solution III的用量也要相应增加。

加入10 ml Solution III，立即温和颠倒混匀，可见红黄相间的絮状物产生，继续混匀直到完全变为黄色，室温静置2 min，然后10,000 rpm离心10 min，将上清转移至干净离心管（自备）中，注意不要带入沉淀。

注意：Solution III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如果上清中还有紫色漂浮物，说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。

加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。

注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。

将步骤5中液体与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中（使用当天用平衡液处理的吸附柱，放入50 ml收集管中），静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。10,000 rpm离心1 min，弃收集管中的滤液。

注意：吸附柱的最大容积为15 ml，所以上步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过10 ml，以防发生漏液现象。

向吸附柱中加入5 ml ToxinOut Buffer，室温静置10 min，10,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。

加入10 ml Buffer WB2，室温10,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。

注意：Buffer WB2为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发。

加入5 ml Buffer WB2，室温10,000 rpm离心1 min，弃收集管中滤液。

室温10,000 rpm离心5 min，甩干残留液体。

将离心吸附柱置于一个新的50 ml塑料离心管中，打开管盖，放置5 min，使乙醇彻底挥发干净。

加入1 ~ 2 ml 洗脱液Buffer EB，室温放置2 min，10,000 rpm离心2 min，离心管底溶液即质粒DNA。

注意：为增加洗脱效率，可将得到的质粒溶液重新加入到吸附柱中重复步骤11一次，如需使用去离子水洗脱，可用NaOH调整其pH值在7.0 - 8.5之间。

【低拷贝或大质粒（>10 kb）提取】

如果所提质粒为低拷贝质粒，或大于10 kb的大质粒，或提取农杆菌质粒，或提取革兰氏阳性菌质粒，应加大菌体使用量，使用300 ~ 500 ml过夜培养物，最后洗脱液Buffer EB 60℃水浴预热，吸附和洗脱时可以适当延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。